熒光是George Gabriel Stokes于1852年首次報(bào)道的一種現(xiàn)象。他觀察到螢石在紫外線照射后開(kāi)始發(fā)光。熒光是光致發(fā)光的一種形式，是指一種材料被光照射后會(huì)發(fā)射出光子。發(fā)射光的波長(zhǎng)比激發(fā)光更長(zhǎng)。這種效應(yīng)又稱為斯托克斯位移。

　　熒光在顯微鏡中有著廣泛的應(yīng)用，是觀察特定分子分布的重要工具。細(xì)胞中的絕大多數(shù)分子并不會(huì)發(fā)出熒光，因此必須用熒光分子即所謂的熒光素進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于感興趣的分子可以直接標(biāo)記（例如，用DAPI標(biāo)記DNA），或者使用可與特異性抗體偶聯(lián)的熒光素進(jìn)行免疫染色。免疫染色時(shí)通常必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。

　　熒光顯微鏡還可對(duì)活細(xì)胞或組織進(jìn)行延時(shí)成像。為此，對(duì)于感興趣的蛋白質(zhì)可以使用基因編碼的熒光分子進(jìn)行標(biāo)記，如GFP（綠色熒光蛋白）。對(duì)于感興趣的分子（如Ca2+）還可以使用可逆結(jié)合的合成染料（如fura-2）或轉(zhuǎn)基因天然蛋白質(zhì)（如GFP衍生物）進(jìn)行標(biāo)記。

　　熒光的機(jī)制原理

　　熒光素只有在用對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的光照射下才會(huì)發(fā)出熒光。波長(zhǎng)取決于熒光團(tuán)的吸收光譜，必須確保輸送適當(dāng)量的能量才能將電子提升至激發(fā)態(tài)。電子激發(fā)后只能在這種高能狀態(tài)下停留很短的時(shí)間。當(dāng)電子弛豫到基態(tài)或其他能級(jí)較低的狀態(tài)時(shí)，能量則以光子的形式釋放出來(lái)。由于該過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一定的能量損失，因此與吸收的光相比，熒光素所發(fā)射出的光波長(zhǎng)更長(zhǎng)且能量更低。

　　磷光的機(jī)制原理

　　由于磷光分子發(fā)光的時(shí)間比熒光素長(zhǎng)得多，因此它們儲(chǔ)存激發(fā)能量的方式肯定有所不同。這種差異的基礎(chǔ)在于兩種形式的激發(fā)能級(jí)，即單重激發(fā)態(tài)和三重激發(fā)態(tài)都基于不同的自旋排列。

　　自旋是電子的一種屬性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，自旋描述了由電子旋轉(zhuǎn)引起的角動(dòng)量。電子的自旋方向可以是正方向（+1/2），也可以是負(fù)方向（?1/2）。更高能級(jí)的自旋配對(duì)可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配對(duì)中，單個(gè)角動(dòng)量相互補(bǔ)償，同時(shí)自旋總值為零。這種自旋排列就稱為單重態(tài)。兩種平行自旋互不補(bǔ)償且所得數(shù)值不同于零值，在這種情況下，自旋被稱為三重態(tài)。

　　當(dāng)電子從單重態(tài)激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生熒光。但在某些分子中，被激發(fā)電子的自旋可以在一種稱為系統(tǒng)間交叉的過(guò)程中轉(zhuǎn)換為三重態(tài)。這些電子失去能量，直到它們處于三重基態(tài)。這種態(tài)比基態(tài)具有更高的能量，但也比單重態(tài)激發(fā)態(tài)具有更低的能量。因此，電子無(wú)法切換回單重態(tài)，也不能輕易地返回基態(tài)，因?yàn)榱孔恿W(xué)只允許自旋總值為零。因此分子被困在其能量狀態(tài)當(dāng)中。

　　但從三重基態(tài)到基態(tài)的一些變化有時(shí)還是有可能的。這些變化會(huì)發(fā)射出光子和磷光。由于一次只有少數(shù)事件可能發(fā)生，三重基態(tài)呈現(xiàn)為能量?jī)?chǔ)庫(kù)的形式，因此能夠在更長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)發(fā)出磷光。

　　冷發(fā)光在顯微鏡中的應(yīng)用

　　對(duì)于顯微鏡，熒光是最為實(shí)用的一種冷發(fā)光。熒光素可以很容易地通過(guò)特定的光源（如燈和濾光系統(tǒng)或激光器）在特定波長(zhǎng)下激發(fā)，發(fā)射光和激發(fā)光可以通過(guò)波長(zhǎng)來(lái)加以區(qū)分（斯托克斯位移）。

　　利用熒光成像，實(shí)驗(yàn)室人員可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的分子數(shù)量和位置進(jìn)行特征描述。熒光顯微鏡的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使用幾種熒光素。熒光素只需其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)不同即可。因此，不同目標(biāo)分子均可同時(shí)觀察并開(kāi)展大量的實(shí)驗(yàn)，例如開(kāi)展共定位的研究等。